生物治疗药物和治疗性蛋白质的市场在2018年价值931.4亿美元，预计到20221年底将增长近一倍。然而，对高产哺乳动物CHO细胞株的选择仍然代表着生物制药生产过程开发中的主要瓶颈。因此，开发新的高通量方法以有效和具有成本效益的方式选择高表达的CHO细胞株变得越来越重要。
使用多轮甲氨蝶呤(MTX)或蛋氨酸亚砜亚胺(MSX)诱导的基因扩增和有限稀释的传统方法效率低下，费时，费力，并且并不总是能产生具有所需生产水平的克隆。FACS的筛选方法可以提高效率和通量，但需要大量的资金投入，密集的操作员培训和专门的人员。FACS工作流由于与细胞直接接触的非一次性组件而容易受到交叉污染。
此外，对于对流体压力敏感的细胞株，细胞可能显示出较低的生存力，并且在FACs筛选后不能很好地恢复。
优势
提供有效且快速的过程来产生重组CHO细胞株，产生高水平的治疗性蛋白质
在更早的克隆阶段确定所需的克隆
评估无标签的治疗性蛋白质表达
避免使用特异性抗体进行筛查
轻松实施到任何细胞株开发过程中
在本研究中，使用CloneSelect Single-Cell Printer f.sight和带有荧光报告基因的CHO细胞系，用于快速，早期鉴定产生高水平治疗性蛋白质——重组人白介素15（tr-hIL15）的克隆。编码tr-hIL15和报告蛋白的基因通过内部核糖体进入位点（IRES）连接，因此它们可以在同一mRNA中转录，但可以独立翻译。由于它们来自相同的mRNA分子，因此报告蛋白的表达水平可用于预测每个克隆的治疗性蛋白的相对表达水平。
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材料和方法
重组DNA质粒的构建
为了重组tr-hIL15蛋白与增强的绿色荧光蛋白(EGFP)共表达，将相应的tr-hIL15开放阅读框插入到巨细胞病毒（CMV）启动子下游和IRES上游的哺乳动物表达载体中，随后插入EGFP开放阅读框和SV40 polyA（图1）。为了降低IRES序列的翻译起始效率，删除了ATG11和ATG123-4。重组质粒包含用于选择稳定CHO细胞株的zeocin抗性基因表达盒，所有基因合成，随后的克隆和测序均由GenScript（Piscataway，NJ）进行。
图1基因表达盒示意图。编码治疗蛋白和EGFP报告基因的DNA通过内部核糖体进入位点(IRES)连接，因此它们在同一mRNA中转录，独立地翻译成两种蛋白质。
细胞培养和转染
除了另外说明，其他所有试剂和实验室用具均来自Thermo Fisher Scientific，例如FreeStyle CHO-S细胞系。使用125 mL通气盖摇瓶在37℃，5％CO2、70-80％湿度和125rpm摇动下，使细胞在悬浮液中生长。所用的生长培养基是补充有4mM L-谷氨酰胺的XP CHO Growth A培养基（Molecular Devices）。
使用线性化的tr-IL15-IRES-EGFP质粒和对照的Neon转染系统（Thermo Fisher Scientific）通过电穿孔法转染细胞。将ClonaCell-CHO ACF补充剂（STEMCELL）以3％的浓度添加到生长培养基中，以帮助新鲜转染的细胞恢复。在48-72h的恢复期后，转染的细胞在XP CHO Growth A选择培养基中以3-5x105细胞/mL的活细胞密度重新接种，该培养基中添加了4 mM L-谷氨酰胺和100 ug/mL Zeocin试剂。随后对稳定的细胞池进行200 ug/mL和300 ug/mL Zeocin选择。
荧光辅助分选和克隆筛选
f.sight分选前24–48小时，将稳定的池细胞以5x105活细/mL的浓度接种在新鲜XP CHO Growth A选择培养基中，并加入300 ug/mL Zeocin。在分选当天，用CloneSelect SingleCell Printer f.sight分选了60µL单细胞悬液，其活细胞数为1x106/mL。将按大小，圆度和平均荧光强度分类的细胞以每孔一个细胞的密度接种到预装有完全克隆培养基的标准96孔板（Corning 3300）中。
完全克隆培养基是不含Zeocin的EX-CELLCHO克隆培养基（Sigma SAFC），其中添加了4 mML-谷氨酰胺和2.5％CHO ACF补充剂。在分选后第0、1、2、7和14天，将所有接种的孔在CloneSelectImager（仅具有透射光）上成像，以验证单细胞来源的克隆。将确认的单细胞克隆依次从96孔板扩展到24孔板，6孔板和摇瓶中，从此时起，将克隆维持在无Zeocin的XP CHO Growth A培养基中，并补充4 mM L-谷氨酰胺。
蛋白质生产分析
对于细胞生长和细胞克隆分析稳定性研究，每3-4天以1x105活细胞/mL的浓度重新接种细胞。对于所有其他摇瓶分析，将细胞以3x105活细/mL的浓度接种在20 mL补充4 mM L-谷氨酰胺的XP CHO Growth A培养基中。在接种后的第三天收获条件培养基。将所有培养基样品离心以除去细胞和碎片，然后在-80℃下保存。通过ELISA（ab218266，Abcam）测定tr-hIL15蛋白效价，并在接种开始时和最终样品收集时间点测量总细胞数，以计算比生产率（SPR）。SPR以每细胞每天产生的皮克蛋白为单位（pg细胞-1天-1:pcd）计算生长速率和生产率5,这为评估和比较细胞株提供了更全面的方法。
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结果
基于EGFP的f.sight荧光辅助分选法
预测克隆治疗性蛋白效价
基于报告系统的CloneSelect Single-Cell Printer f.sight，开发了克隆选择方法以分离产生高水平治疗性蛋白质的单细胞。在该系统中，报告蛋白的表达水平用于预测每个细胞的治疗性蛋白的相对表达水平。将来自稳定转染的具有不同荧光强度的池中的细胞接种到96孔板中，以获得单细胞克隆，并在接种后三周通过ELISA测定这些克隆分泌的治疗性蛋白(图2a)。通过CloneSelect Single-Cell Printer f.sight以相对荧光单位(RFU)定量接种的每个细胞的平均荧光强度，根据细胞的RFU水平(EGFP表达水平)将其分为四组(A，B，C，D)，与具有低EGFP表达的A组相比，具有高EGFP表达的B–D组中观察到的相对trhIL15蛋白质表达的平均水平增加了2.9–4.4倍。
这表明，通过选择性分离荧光强度较高的细胞(EGFP表达中-高水平)，我们可以去除单细胞分选阶段表达水平低的不必要细胞，并在克隆早期将资源优先分配到蛋白表达水平较高的细胞上。
图2(A)具有中高EGFP表达的B-D组相对蛋白表达的平均水平为319±57.3µg/L至477±124µg/L(mean±sem)，较EGFP表达低的A组要好，高2.9至4.4倍。样本量A：n=22；B：n＝23。C：23;D：n＝12。(B)将十二个代表性克隆按比例放大到125 mL摇瓶中。这些克隆扩增前3天的蛋白产量与96孔板扩增前21天的蛋白产量呈正相关(r=0.89)。
为了评估细胞在96孔板中的蛋白质产量(早期)和在摇瓶中的效价(后期)之间的相关性，我们将C组的12个克隆扩展到摇瓶中。接种后第三天，从这些摇瓶中收获条件培养基，接种密度为每毫升3x105个活细胞，并通过ELISA定量tr-hIL15蛋白的表达(图2b)。96孔板中单细胞克隆的21天蛋白质产量与125 mL摇瓶中这些克隆的3天蛋白质产量相关(r=0.89)。但是，我们无法从分类为D组的细胞中识别出相同的模式(数据未显示)。D组中具有最高EGFP表达和最高平均蛋白质表达水平的细胞不能很好地扩展，十二个克隆中有四个在扩展过程中死亡。
克隆稳定性评估
在开发治疗性蛋白质时，评估克隆稳定性是细胞株开发的关键步骤。ICH Q5D guidelines6要求生物制药厂商进行稳定性试验以确保一致的产品质量，前提是一致的细胞应产生一致的产品。对于一次生产运行，从细胞池到生产生物反应器的细胞扩增的平均时间线约为60代，因此克隆稳定性试验通常设计为运行相同的时间。
在这里，我们选择了克隆2G11，这是摇瓶研究中效价最高的克隆之一，用于稳定性测试。在图3a中，克隆2G11在连续传代过程中显示出稳定的细胞生长。在图3b中，重复测量了SPR，从0.201到0.157(pg cell-1 day-1)，在试验过程中损失了-0.044(-22％)。通常，在试验过程中生产率损失(此处通过SPR测量)小于30％的克隆将被认为是稳定的。如图3a-b所示，克隆2G11表现出所需的特征，具有稳定的细胞生长和稳定的蛋白质产生，这表明该克隆可能是提出进一步表征的良好候选者。
图3(A)重复测量细胞密度和活力，每3-4天以1x105活细胞/mL的浓度重新接种到摇瓶中。(B)比生产率(SPR)在从第一代细胞传代到第19代细胞的试验期间，以每细胞每天产生的皮克蛋白(pg细胞-1day-1)为单位重复测量。
结论
本研究建立了一种高效的制备高水平治疗性蛋白重组CHO细胞株的方法。另外，在96孔板中快速选择性地筛选克隆的能力允许在克隆的早期阶段去除不需要的克隆，从而提高了过程效率。选择性筛选克隆后，具有高EGFP表达的克隆平均生产率提高到0.174 pg cell-1 day-1，比未分选的亲本稳定池(0.032 pgcell-1 day-1)高出5.5倍左右。
此外，由于这种方法不依赖于所表达的治疗蛋白或报告蛋白的特异性抗体，它可以很容易地应用于任何细胞株开发过程中。
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